扫描拉曼光谱成像技术通过在样品表面进行逐点拉曼光谱采集，将每个采样点的光谱信息转化为图像像素，从而构建出反映样品化学组成和结构分布的二维或三维图像。在生物组织分析中，这一技术因其非破坏性、无需标记和能够提供分子水平信息的特点，逐渐成为组织病理学研究和疾病诊断的辅助工具。本文通过一个具体的研究案例，展示扫描拉曼光谱成像在生物组织分析中的应用流程和分析方法。 研究背景：某研究团队需要对肝癌组织和癌旁正常组织进行分子水平的比较分析，以寻找与肝癌发生发展相关的生化特征变化。传统的组织病理学分析主要依赖HE染色和免疫组化，这些方法虽然成熟，但需要对组织进行固定、切片和染色等处理，且只能检测预先设定的靶标分子。拉曼光谱成像可以在不进行标记的情况下，同时获取组织中多种生物分子的分布信息，包括蛋白质、脂质、核酸和糖原等，为肝癌组织的分子特征分析提供更全面的视角。
样品制备：研究团队从手术切除的肝癌标本中取出坏死组织较少的区域，分别切取肿瘤组织和癌旁正常组织各一块。样品经过液氮速冻后，使用冷冻切片机切成厚度约为10微米的薄片，放置在镀有铝膜的载玻片上。选择铝膜载玻片的原因是铝在常用的拉曼激发波长下几乎不产生拉曼信号，且具有较高的反射率，可以增强背向散射信号的收集。切片在室温下干燥约30分钟后，即可进行拉曼扫描测量。需要注意的是，生物组织样品在激光照射下可能发生热损伤和光化学变化，因此在正式扫描前需要进行激光功率的耐受性测试，确定不会引起组织光谱明显变化的功率上限。
仪器配置：研究使用的是一台配备785纳米激光器的共聚焦拉曼显微镜。选择785纳米激发波长的原因是生物组织在该波长下的荧光背景较低，且785纳米激光对组织的光损伤相对较小。系统配备60倍水浸物镜，数值孔径为1.0，水浸介质可以减少激光在组织表面的反射，提高信号收集效率。光谱仪的分辨率约为3厘米倒数，探测范围覆盖200至3200厘米倒数。探测器采用背照式深度耗尽CCD，在近红外波段具有较高的灵敏度。
扫描参数设置：对于每片组织切片，首先在白光模式下观察组织形貌，选择具有代表性的区域进行扫描。扫描区域设定为100微米×100微米，扫描步长为2微米，因此每个扫描区域包含50×50共2500个采样点。每个采样点的积分时间设为2秒，激光功率约为15毫瓦。完成一个区域的扫描大约需要1.5小时。为了评估测量的重复性，在每片切片上选择2至3个区域进行扫描。在扫描过程中，系统保持恒温恒湿环境，以减少组织脱水和环境变化对光谱的影响。
数据预处理：扫描完成后，获得包含2500个光谱的数据集。预处理步骤包括：首先扣除暗背景，即在关闭激光的情况下采集探测器的暗电流信号，从每个样品光谱中减去；其次进行宇宙射线去除，生物样品的拉曼测量中偶尔会出现宇宙射线尖峰，需要通过比较相邻像素的光谱来识别并去除；然后进行基线校正，使用自适应迭代重加权惩罚最小二乘法（airPLS）拟合荧光背景并扣除；最后进行光谱归一化，使用矢量归一化或面积归一化方法，消除激光功率波动和聚焦差异带来的强度变化。
特征峰分析：预处理完成后，对肝癌组织和正常组织的平均光谱进行比较。生物组织的拉曼光谱中，785厘米倒数附近的峰与核酸的磷酸二酯键相关，1004厘米倒数的峰来自苯丙氨酸，1080厘米倒数附近与核酸和磷脂相关，1260至1300厘米倒数区域与蛋白质的酰胺III和脂质的CH2弯曲相关，1440至1460厘米倒数区域与脂质和蛋白质的CH2弯曲相关，1655厘米倒数附近与蛋白质的酰胺I相关，2800至3000厘米倒数区域与脂质和蛋白质的CH伸缩相关。通过比较这些特征峰的强度比，可以发现肝癌组织与正常组织之间的生化差异。例如，肝癌组织中核酸相关峰的强度通常较高，反映了癌细胞增殖活跃导致的核酸含量增加；而脂质相关峰的强度可能降低，与癌细胞中脂代谢的改变有关。
光谱成像分析：基于特征峰的强度分布，可以生成化学组成分布图。例如，以785厘米倒数峰的积分强度为指标，可以生成核酸分布图，显示细胞核在组织中的分布；以2850厘米倒数峰的积分强度为指标，可以生成脂质分布图，显示脂滴和细胞膜的分布。通过对比肝癌组织和正常组织的这些分布图，可以直观地观察到肿瘤区域与正常区域在分子组成上的空间分布差异。在肝癌组织中，核酸分布通常更加密集且不均匀，而脂质分布则呈现不规则的斑块状。
多元统计分析：为了更系统地分析肝癌组织和正常组织的光谱差异，研究团队采用了主成分分析和线性判别分析。主成分分析用于降维和提取主要的光谱变化模式，结果显示前三个主成分可以解释约70%的光谱方差，其中第一主成分主要反映核酸与脂质的相对含量变化，第二主成分与蛋白质的二级结构变化相关。基于主成分的线性判别分析可以将肝癌组织和正常组织的光谱进行分类，交叉验证的分类准确率达到约90%。这一结果表明，拉曼光谱结合统计分析方法具有区分肝癌组织和正常组织的潜力。
更新时间：2026-10-25
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